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間充質干細胞（MSC）具有多向分化的潛能，在體外一定條件下可以誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞。

如何做好干細胞誘導分化？

成骨

1. 接種hMSC：用MSC Attachment solution 預包被24孔盤，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF，接種6x104細胞 (3x104cells/Cm2)。

（注意：若使用其他培養(yǎng)器皿，請適當調整體積。)

2. 置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3. 分化：培養(yǎng)24h后即細胞融合度達到80%時，將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除，每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基。

（注意：若細胞融合度<80%，繼續(xù)再培養(yǎng)一天。）

4. 置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-21天，每2-3天換液。

（注意：培養(yǎng)時間越長，越容易礦化，ARS染色更明顯。）

5. 成骨評價：使用2%的ARS染色液。

成脂

接種hMSC

1. 用MSC Attachment solution 預包被24孔盤，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF，接種6x104 細胞 (3x104 cells/cm2)。注意：若使用其他培養(yǎng)器皿，請適當調整體積。

2. 置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分化

1. 培養(yǎng)24h后即細胞融合度達到80-90%時，將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除，每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基。

注意：若細胞融合度<80%，繼續(xù)再培養(yǎng)一天。

2. 置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天，參照以下建議的替代培養(yǎng)基。

根據(jù)hMSC類型的替代培養(yǎng)基方法

不同來源的hMSC具有不同的多向分化潛能。例如，hMSC-AT需要較短的誘導期(~ 6天)，而比hMSC-BM和hMSC-CT需要10天誘導期。

注意：對于所有不同類型的hMSC，誘導成脂后建議使用維持培養(yǎng)基。避免將液體直接加入到脂肪細胞上，需要非常小心移液，因為脂肪細胞是脆弱的。

hMSC-AT:

一個分化周期/維持培養(yǎng)基

6-8天使用*成脂分化培養(yǎng)基，建議每3-4天換液。

成脂誘導完成后，用維持培養(yǎng)基MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4天。

hMSC-BM:

一個分化周期/維持培養(yǎng)基

8-12天使用*成脂分化培養(yǎng)基，建議每3-4天換液(0.5 ml/well)。

成脂誘導完成后，用維持培養(yǎng)基(MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4天。

hMSC-CT:

至少兩個分化周期/維持培養(yǎng)基

5-10天使用*成脂分化培養(yǎng)基，建議每3-4天換液(0.5 ml/well)。

成脂誘導完成后，用維持培養(yǎng)基替代分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-6天，每2-4天換液。

重復培養(yǎng)周期直到觀測到成熟脂肪細胞（即脂滴的形成）。

成軟骨

1. 接種hMSC，3D培養(yǎng)在 96-well U-bottom培養(yǎng)板中每孔加入100μl MSC NutriStem® XF，接種1x105細胞 (30-40x104 cells/cm2)。無需預包被。

注意：微量培養(yǎng)技術也是一個選擇并且可以激發(fā)球形細胞的形成：接種10μl 1x104cells/ml 入板的中心（終1x105cells/well），使其貼壁2小時，然后加入培養(yǎng)基0.1ml/well。

2. 置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24-48小時內會自發(fā)形成球狀體。

3. 分化：培養(yǎng)24小時后，將MSC NutriStem® XF培養(yǎng)基吸除，每孔加入0.2ml分化培養(yǎng)基。

4. 置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天。

注意：培養(yǎng)時間長，將得到更成熟的軟骨細胞（Alcian Blue染色強度更大）。

5. 每3-4天更換分化培養(yǎng)基（0.2ml/well）。

注意：小心不要吸入球狀體。

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