藻類表型研究全面解決方案

藻類是藍(lán)藻門、眼蟲藻門、金藻門、甲藻門、綠藻門、褐藻門、紅藻門等一系列水生生物的總稱。其形態(tài)種類眾多，小至微米級的單細(xì)胞微藻，大至長達(dá)幾米乃至幾十米的大型褐藻。藻類作為水體中重要的初級生產(chǎn)者，對整個生態(tài)系統(tǒng)乃至地球圈的穩(wěn)定都起著極為重要的作用。萊茵衣藻、藍(lán)藻等模式藻類為功能基因、生物進(jìn)化、光合作用等研究提供了的材料。同時(shí)，很多經(jīng)濟(jì)藻類也在食品、醫(yī)藥、能源等行業(yè)中扮演重要角色。而水華、赤潮等有害生態(tài)現(xiàn)象也是由藻類造成的。因此，對藻類的研究一直是生物學(xué)和生態(tài)學(xué)中非常重要的熱點(diǎn)

目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域引人注目的研究熱點(diǎn)之一——表型組學(xué)研究，還主要集中在植物/作物領(lǐng)域。在藻類領(lǐng)域，表型組學(xué)研究剛剛起步，但發(fā)展速度極為迅猛。藻類表型組學(xué)一方面是藻類基因組學(xué)的補(bǔ)充與驗(yàn)證，解釋基因組和環(huán)境因素對植物表型的復(fù)雜作用及中間的變化過程；另一方面可以用于經(jīng)濟(jì)藻類的抗逆生理研究和遺傳育種，全面分析藻類表型，獲取更優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)藻種；還可以用于水華、赤潮的發(fā)生機(jī)理研究。

藻類表型組學(xué)需要全面分析藻類的表型特征，尤其是光合生理、形態(tài)、顏色、色素組成與分布、不同色素的光合貢獻(xiàn)、脅迫生理等方面的測量與分析，使藻類表型數(shù)字化、生理生態(tài)及功能可視化。這就需要針對藻類表型專門設(shè)計(jì)的技術(shù)解決方案。

方案中所列舉的儀器可以根據(jù)具體研究需求靈活組合，而且所有儀器的認(rèn)可度*，國內(nèi)外科學(xué)家均使用這些儀器發(fā)表了大量科研論文。下面介紹部分系統(tǒng)方案的應(yīng)用案例。

1. 藍(lán)藻光合作用機(jī)理的深入研究

中科院水生生物所王強(qiáng)研究員為了研究亞硝酸鹽脅迫對藍(lán)藻Synechocystis sp. PCC 6803光系統(tǒng)II的脅迫機(jī)制，使用AquaPen手持式藻類熒光測量儀、FL3500葉綠素?zé)晒鈨x（FL6000之前型號）和TL葉綠素?zé)後尮庀到y(tǒng)，分別測量分析了Fv/Fm大光化學(xué)效率、OJIP快速熒光動力學(xué)曲線、QA-再氧化動力學(xué)曲線、S-state測量和TL熱釋光曲線。研究終證明亞硝酸鹽脅迫首先影響Synechocystis sp. PCC 6803 光系統(tǒng)II受體側(cè)(Zhan X, 2017)

左：實(shí)驗(yàn)樣品；中：Fv/Fm；右：OJIP快速熒光動力學(xué)曲線

左：QA-再氧化動力學(xué)曲線；中：S-state測量：右：TL熱釋光曲線

左：AquaPen手持式藻類熒光測量儀；中：FL3500雙調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x；右：TL葉綠素?zé)後尮庀到y(tǒng)

參考文獻(xiàn)：Zhang X, Ma F, Zhu X, Zhu J, Rong J, Zhan J, Chen H, He C, Wang Q. 2017. The acceptor side of photosystem II is the initial target of nitrite stress in Synechocystis sp. strain PCC 6803. Appl Environ Microbiol 83:e02952-16

2. 萊茵衣藻分子事件的多組學(xué)解析

萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的新陳代謝對環(huán)境變化有很好的適應(yīng)性。加利福尼亞大學(xué)的Daniela Strenkert嘗試模擬一個光暗周期，研究這一天中萊茵衣藻的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組變化。這一研究首先要求能夠精確模擬一個動態(tài)變化的培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)還要對相關(guān)培養(yǎng)環(huán)境及藻類密度、生理等進(jìn)行監(jiān)測。這樣才能為后續(xù)的組學(xué)分析提供盡量精準(zhǔn)的樣品。而目前能達(dá)到這一要求的藻類培養(yǎng)監(jiān)測儀器只有FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)。其培養(yǎng)條件設(shè)置如下：

n 多臺FMT150同步培養(yǎng)

n 200 μE紅/藍(lán)光，12小時(shí)晝夜交替，模擬日升日落

n 白天28 ℃，夜晚18 ℃

n 通氣速度0.2 L/min

n 實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度、OD680和pH

恒濁預(yù)培養(yǎng)5天，控制OD680至0.4

左：A.FMT150示意圖，B-D.培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度、OD680和pH；右：不同光強(qiáng)下大光化學(xué)效率Fv/Fm的動態(tài)變化

葉綠素?zé)晒夥治鍪枪夂仙砗捅硇徒M學(xué)研究*的部分。因此本研究同時(shí)使用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)測量不同光強(qiáng)下萊茵衣藻大光化學(xué)效率Fv/Fm的動態(tài)變化，反映光強(qiáng)對萊茵衣藻的影響并與蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析

左：FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)；右：FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

參考文獻(xiàn)：Strenkert D, et al. 2019, Multiomics resolution of molecular events during a day in the life of Chlamydomonas. PNAS 116 (6): 2374-2383

3. 監(jiān)測南極藻類與地衣的氣候響應(yīng)

2006年，捷克在南極James Ross島建設(shè)了Johann Gregor Mendel站。駐扎該站的捷克馬薩里克大學(xué)科研人員從2007年就開展研究當(dāng)?shù)卦孱惡偷匾聦δ蠘O溫度升高的響應(yīng)，從而評估溫室效應(yīng)對南極生態(tài)系統(tǒng)的影響。當(dāng)時(shí)他們使用了專門加強(qiáng)極地適應(yīng)能力的AquaPen/FluorPen系列手持式葉綠素?zé)晒鉁y量儀來檢測藻類和地衣的光合生理和生長狀態(tài)。AquaPen/FluorPen既可以手動操作，也具備無人值守監(jiān)測葉綠素?zé)晒獾墓δ埽谀蠘O的嚴(yán)酷環(huán)境下表現(xiàn)良好。

而近年，科研人員開始使用專門設(shè)計(jì)用于監(jiān)測實(shí)驗(yàn)的Monitoring Pen葉綠素?zé)晒庾詣颖O(jiān)測儀。Monitoring Pen在理想情況下可自動連續(xù)工作2年，配有陸地增強(qiáng)版和水下增強(qiáng)版兩個版本。

左：Johann Gregor Mendel站2007-2009年使用的AquaPen/FluorPen；右：近年開始使用的Monitoring Pen

左：Monitoring Pen陸地增強(qiáng)版；右：Monitoring Pen水下增強(qiáng)版

參考文獻(xiàn)：Barták M, et al. 2009, Long-term study on vegetation responses to manipulated warming using open top chambers installed in three contrasting Antarctic habitats. Structure and function of antarctic terrestrial ecosystems, Masaryk University

4. 萊茵衣藻高光脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制

所有光合生物都必須要應(yīng)對過量光照來避免光合氧化脅迫。對于植物和綠藻來說，高光的響應(yīng)機(jī)制就是光系統(tǒng)II的非光化學(xué)淬滅（NPQ）。這一過程允許光系統(tǒng)II將過量能量以熱量形式安全地耗散掉。PsbS蛋白是這一過程中的重要傳感器。

為了確定PsbS蛋白在萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的NPQ和光保護(hù)中的作用，艾克斯－馬賽大學(xué)Tibiletti T等培養(yǎng)了可以表達(dá)藻類或擬南芥psbS基因的葉綠體轉(zhuǎn)基因株。通過FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進(jìn)行的NPQ成像分析終表明，兩種PsbS蛋白都可以增強(qiáng)萊茵衣藻野生型和npq4突變株的NPQ，但通過Fv/Fm測量沒有觀察到明確的光保護(hù)活性。

左：NPQ成像圖；中：光暗周期中的NPQ動態(tài)變化；右：Fv/Fm數(shù)據(jù)分析

同時(shí)，他們還使用了兩個白光LED光源板來模擬持續(xù)高光脅迫（1200 µmol m-2 s-1）；Fytoled光源系統(tǒng)來模擬波動光照條件（3分鐘1200µmol m-2 s-1+3分鐘45µmol m-2 s-1）進(jìn)行生長率實(shí)驗(yàn)；FluorCam系統(tǒng)自帶藍(lán)色LED光源板模擬波動光照條件（3分鐘1200µmol m-2 s-1+3分鐘20µmol m-2 s-1）進(jìn)行Fv/Fm分析。這些LED光源板實(shí)際都來自于同一技術(shù)來源，即PSI公司的SL3500 LED光源板。這一LED光源的開發(fā)就是為了給FluorCam系統(tǒng)測量葉綠素?zé)晒獬上裉峁└邚?qiáng)度、高均一度、高純度的光照，同時(shí)配備精確到微秒級的自動調(diào)控功能。以此LED光源為基礎(chǔ)開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)自然就具備了其他培養(yǎng)系統(tǒng)無法達(dá)到的高性能。歐美很多研究者都會使用這一光源搭建自己設(shè)計(jì)的培養(yǎng)系統(tǒng)。比如2012年Nature發(fā)表的“Recovery rates reflect distance to a tipping point in a living system”一文中，作者就使用了SL3500光源搭建了自主設(shè)計(jì)的藻類培養(yǎng)系統(tǒng)。

左：FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)；中：SL3500 LED光源板；右：AlgaeTron/FytoScope藻類/植物培養(yǎng)箱

參考文獻(xiàn)：Tibiletti T, et al. 2016. Chlamydomonas reinhardtii PsbS protein is functional and accumulates rapidly and transiently under high light. Plant Physiology, 171(4): 2717-2730