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　摘要：結(jié)合國外糞大腸菌群的酶底物檢測方法，針對某次突發(fā)環(huán)境污染事件，用酶底物法和標(biāo)準(zhǔn)多管發(fā)酵法同步檢測受污染地表水中的糞大腸菌群，討論酶底物法在應(yīng)急檢測中檢測糞大腸菌群的適用性。結(jié)果表明，兩種方法的測定數(shù)據(jù)顯著相關(guān)，沒有統(tǒng)計學(xué)差異ρ＞0.05。相對于多管發(fā)酵法，酶底物法特異性強(qiáng)，檢測時間短，二次污染少，符合應(yīng)急檢測的要求。
應(yīng)急監(jiān)測指突發(fā)環(huán)境事件發(fā)生后,對污染物種類、濃度和污染范圍進(jìn)行的監(jiān)測。
糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群,是水質(zhì)污染的重要指標(biāo)之一,也是環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和排放標(biāo)準(zhǔn)中*的控制指標(biāo)之一。快速、準(zhǔn)確地檢測糞大腸菌群直接關(guān)系突發(fā)水環(huán)境污染事件中水體的糞便污染評價,以及采取的應(yīng)急措施和生活用水的安全。
在目前國內(nèi)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中,糞大腸菌群檢測多選用經(jīng)典方法多管發(fā)酵法和濾膜法,操作較繁瑣,需要48h~72h才能獲得結(jié)果,難以滿足突發(fā)性環(huán)境污染事故監(jiān)測及時、準(zhǔn)確的要求。酶底物法是一種新型酶技術(shù)檢測方法,2003年從美國引入我國,用于大腸桿菌檢測。該方法利用糞大腸菌群在44.5℃生長過程中產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解培養(yǎng)液中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃色反應(yīng)(陽性),從而指示糞大腸菌群的存在。
在美國,90%以上的實驗室使用酶底物檢測技術(shù);在加拿大、日本的飲用水市場,酶底物法的使用率高于其他檢測方法的總和;在我國,該法也日益普及,擁有相關(guān)設(shè)備的各級環(huán)境監(jiān)測站達(dá)百余家,目前已作為檢測水中總大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法列入《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)。使用酶底物法檢測水中糞大腸菌群尚未正式列入國家標(biāo)準(zhǔn),使酶底物法的應(yīng)用范圍受到限制。
為了建立糞大腸菌群簡單、準(zhǔn)確的快速檢測法,以標(biāo)準(zhǔn)中的Colilertech酶底物法為基礎(chǔ),通過某水體一次污染事故中糞大腸菌群的連續(xù)監(jiān)測過程分析,將酶底物法與多管發(fā)酵法作比對,探討糞大腸菌群酶底物快速檢測法在應(yīng)急監(jiān)測中運(yùn)用的可行性,為酶底物法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的編制提供技術(shù)參考。
1研究方法和設(shè)備
1.1儀器高壓滅菌器1臺,培養(yǎng)箱2臺,立科封口機(jī),移液器,振蕩器等。
1.2樣品水樣來源于受污染的地表水,按照《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)》(HJ494-2009)的規(guī)定采集約
500mL水樣,置于滅菌采樣瓶中,在0℃~4℃低溫保存,送至實驗室分析。
1.3檢測方法
1.3.1酶底物法基于標(biāo)準(zhǔn)中的Colilertech酶底物法,培養(yǎng)基由西安立科公司提供。目前立科酶底物培養(yǎng)基已經(jīng)獲得《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗法》認(rèn)可。檢測時用100mL無菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入(2.7±0.5)g培養(yǎng)基粉末,混搖均勻使其*溶解后,全部倒入97孔無菌定量盤內(nèi),用立科封口機(jī)封口,放入培養(yǎng)箱中于(44.5±1)℃培養(yǎng)24h后判讀結(jié)果。
2試驗結(jié)果和分析
2.1試驗結(jié)果共采集124個水樣,分別用酶底物法和多管發(fā)酵法測定糞大腸桿菌,結(jié)果見圖1,線性回歸分析見圖2。由圖2可見,兩種方法的測定數(shù)據(jù)在指數(shù)水平上呈現(xiàn)明顯的一致性,測定結(jié)果之間有較好的趨勢性,線性回歸方程為y=1.3355x-209.77,R2為0.7588,相關(guān)性較為顯著。


2.2可信度檢驗分別用NSI公司和ERA公司提供的糞大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣,對酶底物法和多管發(fā)酵法進(jìn)行方法質(zhì)控,陰性檢測和陽性檢測的結(jié)果見表1。由表1可見,酶底物法和多管發(fā)酵法的檢測結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi),可用于后續(xù)實驗分析。
2.3兩種方法比對分析運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,對酶底物法和多管發(fā)酵法做配對t檢驗分析,結(jié)果見表2。表1兩種方法的可信度檢驗MPN/100mL方法檢測結(jié)果QC值置信范圍結(jié)果評判酶底物法(NSI公司)579681182~2560良好多管發(fā)酵法(ERA公司)490797346~1250良好表2兩種方法的t檢驗結(jié)果Table2ttestofthetwomethods成對差分均值標(biāo)準(zhǔn)差均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差差分的95%置信區(qū)間下限上限t值dfP值-0.044200.663800.05961-0.162200.07379-0.7421230.460

由表2可見,兩種方法的相關(guān)度為0.836,P值為0.460,表明二者相關(guān)性良好,兩種方法無顯著性差異。
因此,將酶底物法用于環(huán)境中糞大腸菌群檢測,方法可行,結(jié)果可信。
2.4環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)判讀根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838-2002),對124個樣品的酶底物法和多管發(fā)酵法檢測結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)評判比較,變化率為0.8%~6.5%,在可接受范圍內(nèi)(見表3)。此次被檢樣品的水質(zhì)介于Ⅱ類~Ⅴ類之間,與上海地區(qū)地表水糞大腸菌群評價結(jié)果的范圍基本一致。表3酶底物法和多管發(fā)酵法的標(biāo)準(zhǔn)評判比較

水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)類別Ⅰ類Ⅱ類Ⅲ類Ⅳ類Ⅴ類(劣Ⅴ類)酶底物法樣品數(shù)n/個7702423占比/%5.656.519.418.5多管發(fā)酵法樣品數(shù)n/個5632531占比/%4.050.820.225.03討論從結(jié)果一致性的角度,酶底物法與多管發(fā)酵法沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異,此次樣品檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報道的多管發(fā)酵法與酶底物法的比對試驗結(jié)果具有較好的一致性。從檢測原理上分析,多管發(fā)酵法主要基于糞大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的生化原理,而酶底物法則應(yīng)用酶技術(shù),利用糞大腸桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,分解鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷使培養(yǎng)基顯色的原理檢測,反應(yīng)專性更強(qiáng)。因此,相對于多管發(fā)酵法15%的假陽性和10%的假陰性,酶底物法出現(xiàn)假陰性和假陽性的現(xiàn)象較少,僅占2%。從實驗操作的角度,多管發(fā)酵法需要重復(fù)接菌,造成污染的幾率較大,而酶底物法取樣加藥后封口培養(yǎng),過程簡單,較少受人為污染。

從檢測結(jié)果分析,雖然二者均采用較大可能數(shù)法,但多管發(fā)酵法的較大可能數(shù)表僅有56組,該試驗采用的酶底物法97孔定量盤的較大可能數(shù)表有2352組,其統(tǒng)計概算結(jié)果更加準(zhǔn)確。由此可見,與多管發(fā)酵法相比,酶底物法操作簡便,檢測速度較快,二次污染少,準(zhǔn)確性較高。雖然酶底物法材料成本略高,但綜合考慮管理和人員成本,仍在可接受范圍內(nèi),可以作為應(yīng)急環(huán)境監(jiān)測中微生物污染的快速監(jiān)測方法。兩種方法的比較見表4。

采用酶底物法檢測糞大腸菌群時,需注意以下幾點:
(1)樣品的均勻性。水樣需搖勻,并盡快與培養(yǎng)基混合,否則可能導(dǎo)致結(jié)果差異性很大,喪失方法的穩(wěn)定性優(yōu)勢。
(2)稀釋比的合理性。研究發(fā)現(xiàn),水樣稀釋倍數(shù)越高,酶底物法的測定值越偏低。因此,在日常檢測工作中,應(yīng)根據(jù)具體情況對水樣做小倍數(shù)稀釋,使結(jié)果更加準(zhǔn)確、真實。
(3)培養(yǎng)溫度的恒定性。樣品在培養(yǎng)箱中于44.5℃培養(yǎng),誤差控制在±0.5℃,溫度偏低或偏高都直接影響檢測結(jié)果。
檢測方法操作步驟場所和人員要求確認(rèn)實驗檢測時間準(zhǔn)確度檢測費(fèi)用推廣度多管發(fā)酵法繁瑣專業(yè)場所和人員需要48h~72h較準(zhǔn)確較便宜易酶底物法簡易要求不高不需要24h準(zhǔn)確較便宜。
4結(jié)語
酶底物法以糞大腸菌群的特異性酶與特異性底物產(chǎn)生特異反應(yīng)為原理,具有檢測快速、準(zhǔn)確的特點。方法操作簡便,檢測周期短,能準(zhǔn)確判斷水樣受糞便污染狀況,符合突發(fā)性環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測實時、快速、準(zhǔn)確的要求,將得到更為廣泛和標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用。糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測中的應(yīng)用結(jié)合國外糞大腸菌群的酶底物檢測方法,針對某次突發(fā)環(huán)境污染事件,用酶底物法和標(biāo)準(zhǔn)方法多管發(fā)酵法同步檢測受污染地表水中的糞大腸菌群,討論酶底物法在應(yīng)急監(jiān)測中檢測糞大腸菌群的適用性。結(jié)果表明,兩種方法的測定數(shù)據(jù)顯著相關(guān),沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。相對于多管發(fā)酵法,酶底物法特異性強(qiáng),檢測時間短,二次污染少,符合應(yīng)急監(jiān)測的要求。