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　　細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在正常生命周期結(jié)束時(shí)通過(guò)特定的信號(hào)通路自然死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和更新的重要機(jī)制，在生物體內(nèi)的多種組織中都發(fā)揮著重要作用。

　　一、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

　　原理：正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱(chēng)的，活細(xì)胞中磷脂酰絲氨suan(phosphatidylserine,PS)位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin V是一種對(duì)PS有高度親和力的、鈣依賴(lài)性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS,而活細(xì)胞的PS位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無(wú)法與Annexin V特異性結(jié)合。所以可以用FITC偶聯(lián)的annexin V鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。

　　壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS,所以Annexin V無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過(guò)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

　　二、線粒體膜電位檢測(cè)

　　原理：JC-1是親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。正常生理狀態(tài)下，線粒體負(fù)電性高，JC-1進(jìn)入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強(qiáng)，細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體去極化產(chǎn)生，負(fù)電性降低，JC-1則以單體存在細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光增強(qiáng)。

　　三、TUNEL法

　　原理：TUNEL的全稱(chēng)是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。

　　細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴(lài)的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物su形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法一般稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。

　　由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。

　　TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

　　四、ISOL檢測(cè)法

　　原理：與TUNEL凋亡檢測(cè)法類(lèi)似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過(guò)末端標(biāo)記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng)新在于利用ISOL方法，在DNA片段的平端或3’端單個(gè)突出堿基進(jìn)行連接擴(kuò)增，鑒于只有發(fā)生凋亡的細(xì)胞才會(huì)發(fā)生平端或3’端單個(gè)堿基突出，所以ApopTag過(guò)氧化物酶ISOL凋亡檢測(cè)試劑盒能夠明確的區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

　　五、DNA凝膠電泳(DNAladder)

　　凋亡過(guò)程中DNA裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的重要過(guò)程，DNA凝膠電泳也曾被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡判定的金標(biāo)準(zhǔn)之一。抽提細(xì)胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正?；罴?xì)胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA被裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體，電泳時(shí)呈現(xiàn)特征性的“階梯狀”（ladder）條帶，壞死細(xì)胞的DNA是被隨機(jī)破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時(shí)出現(xiàn)類(lèi)似血涂片的連續(xù)性改變。此方法是判斷細(xì)胞有無(wú)凋亡發(fā)生的一種簡(jiǎn)便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細(xì)胞的檢測(cè)。

　　六、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測(cè)定

　　ELISA是定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的免疫化學(xué)法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細(xì)胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結(jié)合；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結(jié)合；加酶的底物，測(cè)光吸收值。此方法敏感性高，所需細(xì)胞數(shù)少，可檢測(cè)低至5×102/mL的凋亡細(xì)胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。