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　　1. Freestyle™ 293-F細(xì)胞的培養(yǎng)：在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng);轉(zhuǎn)染當(dāng)天Freestyle™ 293-F細(xì)胞密度達(dá)到1.5-2.5×106個(gè)/ml時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但細(xì)胞存活率需>95%;可以使用生產(chǎn)的臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒(C0011)進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)。

　　2. 以50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細(xì)胞為例，取兩個(gè)潔凈無菌離心管，分別加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F細(xì)胞培養(yǎng)液;然后其中一管加入50μg質(zhì)粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑，分別用移液器輕輕吹打混勻，請(qǐng)?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將含有DNA的培養(yǎng)液用槍輕輕加入含Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15分鐘(室溫存放6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定)。

　　3. 把2.5ml Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑-DNA混合物全部加入到50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細(xì)胞中。由于青mei素/鏈mei素雙抗可能影響重組蛋白的表達(dá)，通常不建議在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)加入雙抗;如細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境容易發(fā)生污染，可酌情加入1/5常規(guī)用量的雙抗。

　　4. Freestyle™ 293-F細(xì)胞在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，即可收集細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)和純化。

　　常見問題：

　　1. 轉(zhuǎn)染效率低：

　　a. 優(yōu)化質(zhì)粒與Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑比例，有必要是可以適當(dāng)嘗試加大質(zhì)粒用量。

　　b. 應(yīng)使用高純度、無菌、無污染物的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染?？梢允褂蒙a(chǎn)的質(zhì)粒大量抽提試劑盒(D0026)進(jìn)行抽提，以保證可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

　　c. 需用無抗生素和無血清培養(yǎng)液配制Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的混合物。

　　d. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間不足，而被誤認(rèn)為轉(zhuǎn)染效率偏低。懸浮狀態(tài)下的Freestyle™ 293-F細(xì)胞轉(zhuǎn)染后至顯著表達(dá)所需培養(yǎng)時(shí)間通常為48-72小時(shí)。

　　e. 檢查細(xì)胞是否有支原體感染，支原體感染會(huì)影響細(xì)胞增殖，并很可能影響轉(zhuǎn)染效率。

　　f. 如果沒有檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)，應(yīng)該仔細(xì)核對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，確保測(cè)序結(jié)果和讀碼框wan全正確。

　　g. 檢查轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度是否過高。

　　2. 細(xì)胞毒性較明顯：

　　a. 目的基因的表達(dá)蛋白有毒性。此時(shí)可以和空載體轉(zhuǎn)染效果比較，以確定是否是目的基因蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。如果確定有細(xì)胞毒性，可以考慮適當(dāng)減少質(zhì)粒用量，并按照比例減少Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑。

　　b. 檢查轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度是否太低。

　　c. 檢查細(xì)胞是否有支原體等微生物污染。