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　　【中國儀器網(wǎng) 產(chǎn)品文庫】近年來，酶標(biāo)儀在臨床實驗室中的應(yīng)用越來越普及，使得酶免疫分析法(EIA)的自動化程度及性愈來愈高，尤其是近幾年，進(jìn)口的、國產(chǎn)的單、多通道全自動酶標(biāo)儀的種類及型號發(fā)展非常迅猛，是臨床實驗室自動化程度繼生化分析儀、血細(xì)胞計數(shù)儀、*等之后的又一次更新和提高。
 

酶標(biāo)儀
 

　　然而，國內(nèi)外有關(guān)酶標(biāo)儀性能系統(tǒng)評價的方法甚少，有的評價指標(biāo)簡單且不全面，有的對其性能評價所采用的方法不盡一致，導(dǎo)致不同儀器之間、廠家與用戶之間、用戶與用戶之間的評價指標(biāo)缺乏可比性，這是由于酶標(biāo)儀在制造工藝(多通道檢測器)、測定原理(垂直光路光度測定法)與其它水平光路光度測定的儀器(721分光光度計)之間存在著很大的差別。因此，我們對國內(nèi)外幾個不同廠家和型號的儀器經(jīng)過系統(tǒng)研究論證，初步建立了一套較為完善的酶標(biāo)儀性能評價指標(biāo)與鑒定的基本方法。經(jīng)初步應(yīng)用，效果滿意，應(yīng)廣大讀者和用戶的要求，擬將酶標(biāo)儀性能評價與鑒定方法的理論及其原理作一介紹和補充，以供同行在評價、鑒定和使用儀器時參考，從而為進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的室內(nèi)重復(fù)性和室間可比性提供可靠的保證。
 

　　1.方法與原理
 

　　1.1濾光片波長精度檢查及其峰值測定
 

　　1.1.1方法及其衡量的標(biāo)準(zhǔn)：用高精度紫外可見分光光度計(波長精度±0.3nm)對不同波長的濾光片進(jìn)行光譜掃描，檢測值與標(biāo)定值之差即為濾光片波長精度，其差值越接近于零且峰值越大表示濾光片的質(zhì)量越好，波長精度越高。
 

　　1.1.2理論基礎(chǔ)：酶標(biāo)儀的濾光片質(zhì)量好壞，直接影響儀器的靈敏度高低，而濾光片的質(zhì)量又是以其波長精度及其峰值指標(biāo)來衡量的，因此濾光片波長精度及峰值是衡量酶標(biāo)儀的重要參數(shù)之一，這在廠家的儀器說明書中雖未曾提及，但在儀器的實際使用過程中，我們發(fā)現(xiàn)對濾光片波長精度和峰值進(jìn)行檢查是重要的也是必要的，通過檢查可以發(fā)現(xiàn)濾光片的波長標(biāo)定值與實測值的符合程度，可以發(fā)現(xiàn)濾光片的質(zhì)量是否符合要求。
 

　　1.2靈敏度和準(zhǔn)確度的監(jiān)測
 

　　1.2.1方法：①靈敏度：配制6ug/ml重鉻酸鉀(干燥)溶液(0.05mo1/L硫酸溶解)，加入200ul重鉻酸鉀溶液于小孔杯中，以0.05mo1/L硫酸溶液作空白，于450nm(參比波長650nm)測定，其吸光度應(yīng)≥0.01
 

　　A。②準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確配制：1mmo/L對硝基*(提純品)水溶液，然后以10mmo1/L氫氧化鈉溶液25倍稀釋之，加入200ul稀釋液于小孔杯中，以10mmo1/LNaOH溶液作空白，于405nm(參比波長650nm)檢測，其吸光度應(yīng)在0.4A(0.395～0.408A)左右。
 

　　1.2.2說明：儀器的靈敏度和準(zhǔn)確度主要受兩個因素影響：一是濾光片波長的精度，二是檢測器的質(zhì)量。通常情況下，濾光片原因?qū)е聝x器的靈敏度和準(zhǔn)確度下降比較容易檢查；而檢測器質(zhì)量差異則不易被發(fā)現(xiàn)，因此我們采用上述兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液對儀器檢測器的質(zhì)量進(jìn)行定期監(jiān)測，從而保證了儀器檢測結(jié)果的可靠性。對于儀器準(zhǔn)確性的測定，我們采用了文獻(xiàn)報道的方法，經(jīng)過多次在不同型號儀器間進(jìn)行反復(fù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)物溶液在450nm波長處有一較為恒定的測定值，由于酶標(biāo)儀與其它分光光度計的光學(xué)原理不*相同，故是否可以作為評價酶標(biāo)儀準(zhǔn)確性的參考方法還有待同行進(jìn)一步研究考證。
 

　　1.3通道差與孔間差檢測
 

　　1.3.1方法及其表達(dá)方式：①通道差檢測：取一只酶標(biāo)板小孔杯(杯底須光滑、透明、無劃痕、無污染)以酶標(biāo)板架作載體，分別加入三種不同濃度的甲基橙溶液200u*后置于8個通道的相應(yīng)位置，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長(測定波長490nm，參比波長630或650nm，以下均相同)連續(xù)測三次，觀察其不同通道之間測量結(jié)果的一致性可用極差值來表示其通道差。②孔間差的測量：選擇同一廠家、同一批號酶標(biāo)板條(8條共96孔)分別加入200ul甲基橙溶液(吸光度調(diào)至0.065～0.070A)先后置于同一通道，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。
 

　　1.3.2理論解釋：為了提高酶標(biāo)儀的檢測速度，根據(jù)96孔酶標(biāo)板的規(guī)格特點，目前大多數(shù)廠家的中、酶標(biāo)儀均采用8通道的檢測器(部分中、低檔酶標(biāo)儀目前仍采用單通道).因而它們每個通道的檢測能力是不盡相同的，它是儀器內(nèi)部的固有誤差，與所測溶液濃度成正相關(guān)(不同檢測器對不同濃度溶液的響應(yīng)能力不同)，所以通道差是衡量酶標(biāo)儀性能良好與否的重要指標(biāo)之一；其衡量指標(biāo)用極差表示，這與廠家推薦的指標(biāo)是一致的；極差值越接近于零，通道差越小，說明同一樣品于不同通道檢測結(jié)果的一致性越好。
 

　　由于不同廠家、不同批號酶標(biāo)板之間的質(zhì)量差異，導(dǎo)致孔與孔之間的檢測結(jié)果也不*一致，這與水平光路光度計的比色皿質(zhì)量是否符合要求一樣，因此我們認(rèn)為孔間差是儀器外部的固有誤差，只有準(zhǔn)確測知孔間差，并對結(jié)果作出相應(yīng)的校正，才能使檢驗結(jié)果更符合實際情況、更準(zhǔn)確可靠；采用的評價指標(biāo)(士1.96s)也是有利于結(jié)果校正的。另外，在設(shè)計孔間差測量的操作方法上，我們將200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.065～0.070A，是充分考慮到加樣器的誤差(上海求精公司，200ul，士2%CV)，其目的是使加樣誤差控制在儀器的分辨率(0.01A)以下，這樣也就避免了孔間差結(jié)果不因加樣誤差而導(dǎo)致假性增高。
 

　　1.4零點飄移
 

　　1.4.1方法：取八只小孔杯，分別置于八個通道的相應(yīng)位置，均加入200ul蒸餾水并調(diào)零，采用雙波長或單波長(490nm)每隔30min測定一次，觀察8個通道4h內(nèi)的吸光度變化。其與零點的差值即為零點飄移。
 

　　1.4.2測量原理：酶標(biāo)儀的零點飄移通常是很小的，這是由于儀器在讀數(shù)之前，先要做8個通道的本底測量(Io).然后再讀取樣品板的各孔測定值(I)，根據(jù)Beer'slaw光吸收值=1ogl0(Io/I)，每次讀數(shù)經(jīng)過如此的自動校正，使得讀數(shù)誤差大大降低，這樣的測讀方式無疑是非常正確的的；另外有的儀器是應(yīng)用"DRLDYE"檢測試條來進(jìn)行吸光度的校準(zhǔn)的，因此在采用單波長測量時，會導(dǎo)致吸光度的假性增高，這種儀器可采取兩種方法進(jìn)行校正，一是選擇一合適的參比濾光片進(jìn)行雙波長測定，二是引入修正參數(shù)，即在吸光度模式下單波長讀取1個空白孔，其測試值和預(yù)測值之差值即為修正參數(shù)。所以零點飄移是評價儀器在一定時間內(nèi)零點吸光度的變化趨勢，與波長無關(guān)，它間接地反映了儀器內(nèi)部檢測系統(tǒng)在單位時間內(nèi)處于工作狀態(tài)下的穩(wěn)定性及儀器的機械性能情況(連續(xù)進(jìn)板、檢測、退出)，故它是評估儀器內(nèi)部電路系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)(檢測器)及機械系統(tǒng)良好與否的指標(biāo)。
 

　　1.5精密度評價
 

　　1.5.1方法及評價指標(biāo)：每個通道三只小杯，分別加入200ul高、中、低三種不同濃度的甲基橙溶液，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長作雙份平行測定，每日測定兩次，連續(xù)測定20天。分別計算其批內(nèi)精密度、日內(nèi)批間精密度、日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV值。
 

　　1.5.2理論依據(jù)：1984年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會發(fā)表了EP5一T文件并于1992年進(jìn)行了第二次修訂：臨床化學(xué)儀器精密度性能的用戶評價。該評價方案在生化分析儀、血細(xì)胞計數(shù)儀等儀器和試劑的評價中得到了廣泛的應(yīng)用，使評價儀器的方法得到了統(tǒng)一；而該法應(yīng)用于酶標(biāo)儀的評價在國內(nèi)外則尚未見有類似的報道，我們采用該法對酶標(biāo)儀進(jìn)行系統(tǒng)評價，結(jié)果是比較滿意的。各指標(biāo)的意義為：批內(nèi)精密度系由20d中每天兩批，每批兩次之差(即"批內(nèi)")經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后所得的結(jié)果；日內(nèi)批間精密度系由20d中每天兩批測定結(jié)果均值之差(即"批間")經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后所得的結(jié)果；日間精密度表示20d中每天所測均值的標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)誤，反映了每日均值的離散度；總精密度則是對批內(nèi)、批間和日間精密度進(jìn)行加權(quán)統(tǒng)計的結(jié)果。其中以批內(nèi)精密度和總精密度的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的批內(nèi)精密度的計算方法(即對同一標(biāo)本在同一天內(nèi)同時重復(fù)測定多次)相比，前者更符合實驗室的實際情況，更有代表性，也更加合理；而總精密度則客觀地全面地反映了實驗室的總體變異情況。
 

　　1.6線性測定
 

　　1.6.1方法：稱取甲基橙配制5個系列濃度的溶液，采用雙波長平行檢測8次求其均值。計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)r及標(biāo)準(zhǔn)估計誤差Sy,x，并用±1.96Sy,x表示樣品的95%測量范圍。
 

　　1.6.2評價指標(biāo)解釋：線性測定也是評價儀器的重要手段之一，因為它是儀器開展定量工作的基礎(chǔ)和前提，某些廠家用標(biāo)準(zhǔn)估計誤差s來衡量線性，這與實驗室通常所采用的相關(guān)系數(shù)r是一致的，因此在進(jìn)行線性評估時，我們同時報告r和Sy,x，目的是為了增強用戶與廠家之間的可比性。
 

　　1.7雙波長評價
 

　　1.7.1方法：在運用酶標(biāo)儀檢測樣品時，由于溶液中的小氣泡、杯底的水紋印及劃痕、小孔杯之間透明度的差異等等，這些都是儀器測定過程中zui常見的干擾因素，而標(biāo)本中的干擾組份(如溶血、黃道)因洗滌而對測定結(jié)果影響則較小，因此我們將文獻(xiàn)中的雙被長評價方法改為：取同一廠、同一批號酶標(biāo)板條(每個通道2條共24孔)每孔加入200ul甲基橙溶液(吸光度調(diào)至0.065～0.070A)先后于8個通道分別采用單波長(490nm)和雙波長(測定波長490nm、參比波長630/650nm)進(jìn)行檢測，計算單波長和雙波長測定結(jié)果的均值、離散度，比較各組之間是否具有統(tǒng)計學(xué)差異以考察雙波長清除干擾因素的效果。
 

　　1.7.2說明：雙波長測定過程中，由于標(biāo)本中干擾組份的存在以及小孔杯本身質(zhì)量等原因，常常導(dǎo)致測定結(jié)果的假性增高，而酶標(biāo)儀提供的雙波長測定功能則可以消除干擾組份或因素對測定結(jié)果的影響.對于標(biāo)本中干擾組份的清除，在選擇參比波長時，我們應(yīng)對于擾組份的光譜進(jìn)行研究，以正確選擇參比波長；而對于小孔杯本身質(zhì)量問題等干擾因素的消除，只要選擇遠(yuǎn)離測定波長的參比波長即可以了、這對保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性是非常重要的。
 

　　2.小結(jié)
 

　　2.1目前，國內(nèi)外有關(guān)酶標(biāo)儀性能評價與鑒定方法的報道尚不多見，由于酶標(biāo)儀在臨床實驗室中的應(yīng)用越來越普及，因而，建立一套完善的酶標(biāo)儀性能評價方法并對儀器進(jìn)行全面的較為系統(tǒng)的綜合評價乃是臨床實驗室工作人員的當(dāng)務(wù)之急，這對進(jìn)一步增強儀器之間的可比性和保證ELA法的工作質(zhì)量是至關(guān)重要的，同時將其評價指標(biāo)引入到檢測結(jié)果的校正工作中，合理地作出各個定性試驗項目的可信限與界值，對正確判讀結(jié)果和開展定量檢測工作具有一定的指導(dǎo)意義。
 

　　2.2在對酶標(biāo)儀進(jìn)行評估時，還應(yīng)對儀器的自動化程度及售后服務(wù)有一個比較全面的了解。自動化程度如儀器的分辨率(一般為0.001A)、報告的方式(通常提供4～6種以上的格式)、可提供濾光片的zui大數(shù)目(有些廠家可根據(jù)用戶要求訂做)、是否提供用戶自編程序及外接微機的功能和軟件等等。
 

　　2.3售后服務(wù)也是儀器使用順利與否的根本保證，用戶應(yīng)當(dāng)與信譽較好、服務(wù)周到、維修方便的代理商進(jìn)行恰談，以免儀器一旦出現(xiàn)故障，而不致于影響工作或使儀器處于癱瘓狀態(tài)不能發(fā)揮應(yīng)有的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
 

　　2.4另外需要強調(diào)的是：由于酶標(biāo)儀的種類、型號繁多，每個儀器的測量原理也不盡相同，為了保證不同儀器之間測定結(jié)果的一致性，我們認(rèn)為在測定時應(yīng)采用雙波長法，而且必須采用雙波長，這樣既能消除干擾組份和干擾因素的影響，又能避免因儀器測量原理不同而造成儀器之間結(jié)果的不一一致性。