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【中國(guó)儀器網(wǎng) 解決方案】質(zhì)譜技術(shù)在蛋白鑒定等實(shí)驗(yàn)中具有不可忽視的作用，不過，目前的應(yīng)用還不是特別廣泛。那么，有問題了怎么解決呢?本文收集了相關(guān)的新手對(duì)于這項(xiàng)技術(shù)的常見問題與解決方法。希望能更好地幫助大家了解這項(xiàng)技術(shù)。
問題1. 一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜有什么區(qū)別?什么時(shí)候做一級(jí)，什么時(shí)候做二級(jí)?
答：一級(jí)質(zhì)譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜(PMF)，即利用質(zhì)譜儀測(cè)量酶解片段的分子量并搜庫比較實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì) 的鑒定，二級(jí)質(zhì)譜是在一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上再選擇部分肽段做進(jìn)一步的破碎并對(duì)碎片進(jìn)行深入分析和比較，鑒定出該肽段的序列并結(jié)合PMF的結(jié)果從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。二級(jí)質(zhì)譜能夠得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。隨著現(xiàn)在雜志對(duì)數(shù)據(jù)的要求越來越嚴(yán)格，二級(jí)質(zhì)譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢(shì)，而且即使目前做一級(jí)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，也需要挑選部分PMF結(jié)果做二級(jí)質(zhì)譜驗(yàn)證。
問題2. 研究的物種不是模式生物 怎么辦?
答：可以參考親緣關(guān)系近的模式生物做比對(duì)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成功鑒定，如果質(zhì)譜圖很好而沒有鑒定結(jié)果說明這是一個(gè)全新的蛋白，可以采用de-novo等技術(shù)做深入分析與鑒定。
問題3. 該如何評(píng)價(jià)質(zhì)譜效果的好壞?
答：做PMF一般得分超過60分(P<0.05)就算成功鑒定，而串聯(lián)質(zhì)譜，得分超過60分或者雖然沒有超過60分，但是有少一條肽段的得分超過30分就算成功鑒定。
問題4. 一些特殊的質(zhì)譜方法有什么用途?
答：質(zhì)譜的其它用途包括磷酸化位點(diǎn)分析、蛋白測(cè)序、混合蛋白鑒定(shotgun技術(shù))以及分子量測(cè)定、二硫鍵位置分析等等。
問題5. 用什么染色方法比較好?
答：用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，銀染也可以，但鑒定成功率稍低，并且推薦用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)銀染蛋白進(jìn)行鑒定可以大大提高鑒定成功率。
問題6. 凝膠是否可以長(zhǎng)期保存?該如何保持?對(duì)鑒定效果有影響嗎?
答：如果保存時(shí)間超過一個(gè)月，可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一個(gè)月，則可以常溫保持，不會(huì)影響質(zhì)譜鑒定效果。
問題7. 質(zhì)譜鑒定取膠點(diǎn)該如何取?有什么注意事項(xiàng)?
答：取點(diǎn)的時(shí)候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點(diǎn)，用槍頭將凝膠戳取下來并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次，后吸干離心管中所有水分封蓋保存。離心管用進(jìn)口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點(diǎn)的時(shí)候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。
問題8. 凝膠是否可以長(zhǎng)期保存?該如何保存?如何運(yùn)送?
答：蛋白凝膠可以長(zhǎng)期保存而不影響質(zhì)譜鑒定效果，一般而言，如果在一兩個(gè)星期以內(nèi)，用保鮮膜包好，放到4度冰箱保存，如果保存時(shí)間超過一個(gè)月，可以把蛋白點(diǎn)取下后放入-20度或者-80度冰箱，不會(huì)影響后續(xù)質(zhì)譜鑒定效果。運(yùn)送膠點(diǎn)的時(shí)候采用常溫運(yùn)送即可，三五天內(nèi)都不會(huì)有太大的影響。
問題9. 質(zhì)譜鑒定取膠點(diǎn)該如何取?有什么注意事項(xiàng)?
答：取點(diǎn)的時(shí)候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點(diǎn)，用槍頭將凝膠戳取下來并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次，后吸干離心管中所有水分封蓋保存并做好標(biāo)記。離心管用進(jìn)口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點(diǎn)的時(shí)候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。
問題10. 一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜該如何選擇?
答：一級(jí)質(zhì)譜的鑒定方法又常稱為肽指紋圖譜鑒定(peptide-mass mapping，PMF)，二級(jí)質(zhì)譜的鑒定方法又常稱為串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。早期蛋白鑒定，因?yàn)榭紤]鑒定成本的問題，一般做測(cè)序生物的蛋白鑒定可以選擇一級(jí)質(zhì)譜，而非測(cè)序生物常選擇二級(jí)質(zhì)譜。現(xiàn)在，二級(jí)質(zhì)譜的價(jià)格也大大降低，和一級(jí)質(zhì)譜并無太大差異，而且可靠性和鑒定成功率都大大提高，本公司一般都推薦客戶(不管是研究測(cè)序生物還是非測(cè)序生物)直接做串聯(lián)質(zhì)譜，而不考慮進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定。
問題11. 質(zhì)譜鑒定大致是什么流程，公司一般都提供那些數(shù)據(jù)?
質(zhì)譜鑒定主要包括蛋白酶解、質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取、對(duì)庫檢索三個(gè)步驟。針對(duì)每一個(gè)蛋白點(diǎn)的鑒定，一般會(huì)提供三種數(shù)據(jù)，具體包括：質(zhì)譜圖(PDF格式，包括1張一級(jí)質(zhì)譜圖和5-10張二級(jí)質(zhì)譜圖)、質(zhì)譜峰列表(text格式，主要是一些質(zhì)譜碎片的信息)、檢索結(jié)果(自己建庫進(jìn)行本地化檢索的一般提供的PDF格式或者excel格式，如果是Mascot在線檢索的一般提供網(wǎng)頁格式)。
問題12. 質(zhì)譜鑒定會(huì)不成功一般有哪些因素?
答：質(zhì)譜鑒定不成功主要可以分為兩類，一類是質(zhì)譜效果不好，一類是沒有可參考的蛋白數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜效果不好的原因又可以細(xì)分為蛋白點(diǎn)太淡以至于蛋白含量過低、蛋白點(diǎn)取得太小不利于操作、雖然經(jīng)過雙向電泳分離但卻是某幾個(gè)蛋白的混合蛋白點(diǎn)、蛋白酶解及質(zhì)譜操作失誤等，要避免這些因素需要盡量取顏色深一些的蛋白點(diǎn)，并且取的蛋白點(diǎn)面積需要適當(dāng)大一些(對(duì)于某些很小但很清晰的蛋白點(diǎn)，取點(diǎn)的時(shí)候可是適當(dāng)選擇孔徑大一些的槍頭，把邊上空白處適當(dāng)取到一些也不要緊)，避免取點(diǎn)可能混合的蛋白點(diǎn)，具備豐富的酶解質(zhì)譜操作經(jīng)驗(yàn)。而由于沒有可參考的數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致的鑒定效果較差，可以通過更換范圍更大的數(shù)據(jù)庫、采用EST數(shù)據(jù)庫以及根據(jù)單個(gè)物種的蛋白數(shù)據(jù)庫構(gòu)建本地質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的方式得到解決。
問題13. 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和質(zhì)譜測(cè)序有什么區(qū)別?
質(zhì)譜鑒定往往采用軟件對(duì)已有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)檢索匹配得到結(jié)果，而質(zhì)譜測(cè)序則需要根據(jù)質(zhì)譜峰圖中相鄰或者相近峰的分子量差異直接推算出肽段的序列。
問題14. 未知蛋白質(zhì)是通過質(zhì)譜還是蛋白質(zhì)測(cè)序儀來測(cè)序的呢?
現(xiàn)在比較簡(jiǎn)單的方法是質(zhì)譜法，而且測(cè)一個(gè)樣品價(jià)格也不高。具體價(jià)格各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不一樣，100-500元吧。如果質(zhì)譜法不能確定的話還可以結(jié)合N端測(cè)序，可測(cè)10幾個(gè)氨基酸。兩個(gè)數(shù)據(jù)結(jié)合分析基本可以確定目的蛋白了，現(xiàn)在的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫相當(dāng)強(qiáng)大了。
后，小小地對(duì)以上的內(nèi)容概括一下，質(zhì)譜用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，蛋白凝膠的保存時(shí)間大于一個(gè)月時(shí)，可將蛋白點(diǎn)取下后放在負(fù)二十度或者負(fù)八十度的環(huán)境中，隨著技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)前二級(jí)質(zhì)譜的價(jià)格與一級(jí)質(zhì)譜相比差異不大，推薦直接做二級(jí)質(zhì)譜。
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