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關(guān)于柱色譜的詳細介紹
柱色譜法，又稱層析法。是一種以分配平衡為機理的分配方法。色譜體系包含兩個相，一個是固定相，一個是流動相。當兩相相對運動時，反復多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質(zhì)的差異，后達到彼此分離的目的。色譜法從發(fā)明到現(xiàn)在已有八十多年的歷史。它是純化和分離有機或無機物的一種常用方法。其中固定相極性大于流動相的色譜為正相色譜，相反的為反相色譜。根據(jù)相似相溶原理：混合物中在固定相中溶解度大的物質(zhì)后出柱，保留時間長，難被洗脫。
一、柱色譜的概念
柱色譜是在一根玻璃管或金屬管中迸行的色譜技術(shù)，將吸附劑填充到管中而使之成為柱狀，這樣的管狀柱稱為吸附色譜柱。使用吸附色譜柱分離混合物的方法，稱為吸附柱色譜。這種方法可以用來分離大多數(shù)有機化合物，尤其適合于復雜的天然產(chǎn)物的分離。分離容量從幾毫克到百毫克級，所以，適用于分離和精制較大量的樣品。
二、吸附柱色譜
在吸附柱色譜中，吸附劑是固定相，洗脫劑是流動相，相當于薄層色譜中的展開劑。吸附劑的基本原理與吸附薄層色譜相同，也是基于各組分與吸附劑間存在的吸附強弱差異，通過使之在柱色譜上反復進行吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程而完成的。所不同的是，在進行柱色譜的過程中，混合樣品一般是加在色譜柱的頂端，流動相從色譜柱頂端流經(jīng)色譜柱，并不斷地從柱中流出。由于混合樣中的各組分與吸附劑的吸附作用強弱不同，因此各組分隨流動相在柱中的移動速度也不同，終導致各組分按順序從色譜柱中流出。如果分步接收流出的洗脫液，便可達到混合物分離的目的。一般與吸附劑作用較弱的成分先流出，與吸附作用較強的成分后流出。
三、吸附劑與洗脫劑
根據(jù)待分離組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇合適的吸附劑和洗脫劑是分離成敗的關(guān)鍵。
⒈吸附劑的要求
一種合適的吸附劑，一般應滿足下列幾個基本要求:
?、艑悠方M分和洗脫劑都不會發(fā)生任何化學反應，在洗脫劑中也不會溶解。
⑵對待分離組分能夠進行可逆的吸附，同時具有足夠的吸附力，使組分在固定相與流動相之間能快地達到平衡。
?、穷w粒形狀均勻，大小適當，以保證洗脫劑能夠以一定的流速 (一般為1.5 mL·min-1)通過色譜柱。
⑷材料易得，價格便宜而且是無色的，以便于觀察?？捎糜谖絼┑奈镔|(zhì)有氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣 (鎂)、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。其中有些對幾類物質(zhì)分離效果較好，而對其它大多數(shù)化合物不適用。
⒉幾種常見吸附劑
?、叛趸X： 市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100~150目。
堿性氧化鋁 (pH 9-10)適用于堿性物質(zhì) (如胺、生物堿)和對酸敏感的樣品(如縮醛、糖苷等)，也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙酰化、維生素A和K等的破壞等不良副反應。所以，這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁 (pH 3.5-4.5)適用于酸性物質(zhì)如有機酸、氨基酸等的分離。
中性氧化鋁 (pH 7-7.5)適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和堿等。
⑵硅膠： 硅膠是硅酸的部分脫水后的產(chǎn)物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。
⑶聚酰胺： 聚酰胺是聚己內(nèi)酰胺的簡稱，商業(yè)上叫做錦綸、尼龍-6或卡普綸。色譜用聚酰胺是一種白色多孔性非晶形粉末，它是用錦綸絲溶于濃鹽酸中制成的(制法詳見附錄十)。不溶于水和一般有機溶劑，易溶于濃無機酸、酚、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中。聚酰胺分子表面的酰氨基和末端胺基可以和酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成強度不等的氫鍵，因此可以分離上述化合物，也可以分離含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
?、裙杷徭V： 中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間，主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。為了得到中性硅酸鎂，用前先用稀鹽酸，然后用醋酸洗滌，后用甲醇和蒸餾水*洗滌至中性。
⒊吸附劑的活度及其調(diào)節(jié)
吸附劑的吸附能力常稱為活度或活性。吸附劑的活性取決于它們含水量的多少，活性強的吸附劑含有少的水。吸附劑的活性一般分為五級，分別用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。數(shù)字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附劑中添加一定的水，可以降低其活性；反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，后者稱為吸附劑的活化。
⒋吸附劑和洗脫劑的選擇
樣品在色譜柱中的移動速度和分離效果取決于吸附劑對樣品各組分的吸附能力大小和洗脫劑對各組分的解吸能力大小，因此，吸附劑的選擇和洗脫劑的選擇常常是結(jié)合起來進行的。首先，根據(jù)待分離物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，結(jié)合各種吸附劑的特性，初步選擇一種吸附劑。然后根據(jù)吸附劑和待分離物質(zhì)之間的吸附力大小，選擇出認為適宜的洗脫劑。后，采用薄層色譜法進行試驗。根據(jù)試驗結(jié)果，再進一步?jīng)Q定是調(diào)節(jié)吸附劑的活性，還是更換吸附劑的種類，或是改變洗脫劑的極性。直到確定出合適的吸附劑和洗脫劑為止。
物質(zhì)與吸附劑之間的吸附能力大小既與吸附劑的活性有關(guān)，又與物質(zhì)的分子極性有關(guān)。分子極性越強，吸附能力越大，分子中所含極性基團越多，極性基團越大，其吸附能力也就越強。具有下列極性基團的化合物，其吸附能力按下列次序遞增：
-Cl，-Br，-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH
四、操作方法
⒈裝柱
色譜柱的大小規(guī)格由待分離樣品的量和吸附難易程度來決定。一般柱管的直徑為0.5～l0 cm，長度為直徑的10～40倍。填充吸附劑的量約為樣品重量的20～50倍，柱體高度應占柱管高度的3/4，柱子過于細長或過于粗短都不好。裝柱前，柱子應干凈、干燥，并垂直固定在鐵架臺上，將少量洗脫劑注入柱內(nèi)，取一小團玻璃毛或脫脂棉用溶劑潤濕后塞入管中，用一長玻璃棒輕輕送到底部，適當搗壓，趕出棉團中的氣泡，但不能壓得太緊，以免阻礙溶劑暢流 (如管子帶有篩板，則可省略該步操作)。再在上面加入一層約0.5 cm厚的潔凈細砂，從對稱方向輕輕叩擊柱管，使砂面平整。
常用的裝柱方法有干裝法和濕裝法兩種。
?、鸥裳b法：在柱內(nèi)裝入2/3溶劑，在管口上放一漏斗，打開活塞，讓溶劑慢慢地滴入錐形瓶中，接著把干吸附劑經(jīng)漏斗以細流狀傾瀉到管柱內(nèi)，同時用套在玻璃棒 (或鉛筆等)上的橡皮塞輕輕敲擊管柱，使吸附劑均勻地向下沉降到底部。填充完畢后，用滴管吸取少量溶劑把粘附在管壁上的吸附劑顆粒沖入柱內(nèi)，繼續(xù)敲擊管子直到柱體不再下沉為止。柱面上再加蓋一薄層潔凈細砂，把柱面上液層高度降至0.1～l cm，再把收集的溶劑反復循環(huán)通過柱體幾次，便可得到沉降得較緊密的柱體。
⑵濕裝法：基該方法與干裝法類似，所不同的是，裝柱前吸附劑需要預先用溶劑調(diào)成淤漿狀，在倒入淤漿時，應盡可能連續(xù)均勻地一次完成。如果柱子較大，應事先將吸附劑泡在一定量的溶劑中，并充分攪拌后過夜 (排除氣泡)，然后再裝。無論是干裝法，還是濕裝法，裝好的色譜柱應是充填均勻，松緊適宜一致，沒有氣泡和裂縫，否則會造成洗脫劑流動不規(guī)則而形成“溝流”，引起色譜帶變形，影響分離效果。
⒉加樣
將干燥待分離固體樣品稱重后，溶解于極性盡可能小的溶劑中使之成為濃溶液。將柱內(nèi)液面降到與柱面相齊時，關(guān)閉柱子。用滴管小心沿色譜柱管壁均勻地加到柱頂上。加完后，用少量溶劑把容器和滴管沖洗凈并全部加到柱內(nèi)，再用溶劑把粘附在管壁上的樣品溶液淋洗下去。慢慢打開活塞，調(diào)整液面和柱面相平為止，關(guān)好活塞。如果樣品是液體，可直接加樣。
⒊洗脫與檢測
將選好的洗脫劑沿柱管內(nèi)壁緩慢地加入柱內(nèi)，直到充滿為止 (任何時候都不要沖起柱面覆蓋物)。打開活塞，讓洗脫劑慢慢流經(jīng)柱體，洗脫開始。在洗脫過程中，注意隨時添加洗脫劑，以保持液面的高度恒定，特別應注意不可使柱面暴露于空氣中。在進行大柱洗脫時，可在柱頂上架一個裝有洗脫劑的帶蓋塞的分液漏斗或倒置的長頸燒瓶，讓漏斗頸口浸入柱內(nèi)液面下，這樣便可以自動加液。如果采用梯度溶劑分段洗脫，則應從極性小的洗脫劑開始，依次增加極性，并記錄每種溶劑的體積和柱子內(nèi)滯留的溶劑體積，直到后一個成分流出為止。洗脫的速度也是影響柱色譜分離效果的一個重要因素。大柱一般調(diào)節(jié)在每小時流出的毫升數(shù)等于柱內(nèi)吸附劑的克數(shù)。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度為宜。
洗脫液的收集，有色物質(zhì)，按色帶分段收集，兩色帶之間要另收集，可能兩組分有重疊。對無色物質(zhì)的接收，一般采用分等份連續(xù)收集，每份流出液的體積毫升數(shù)等于吸附劑的克數(shù)。若洗脫劑的極性較強，或者各成分結(jié)構(gòu)很相似時，每份收集量就要少一些，具體數(shù)額的確定，要通過薄層色譜檢測，視分離情況而定。至2018年，多數(shù)用分步接受器自動控制接收。
洗脫完畢，采用薄層色譜法對各收集液進行鑒定，把含相同組分的收集液合并，除去溶劑，便得到各組分的較純樣品。
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