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細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)控制
Anika Manzke是病毒清除產(chǎn)品經(jīng)理，Birte Kleindienst是病毒清除產(chǎn)品初級(jí)經(jīng)理，二人均供職于Sartorius Stedim Biotech
細(xì)菌、支原體和病毒等各種感染因子對(duì)生物反應(yīng)器的污染會(huì)對(duì)患者安全構(gòu)成潛在的威脅。近年來(lái)，病毒一直是導(dǎo)致多種生物反應(yīng)器污染的原因(1)。許多生物制藥公司已經(jīng)報(bào)告過(guò)鼠細(xì)小病毒(MVM)或皰疹病毒屬(2)等無(wú)包膜細(xì)小病毒對(duì)生產(chǎn)級(jí)生物反應(yīng)器造成的污染。制藥行業(yè)中的許多重量級(jí)公司都加入了CAACB來(lái)共同解決這一問(wèn)題。
制造商可以采取多種方法降低細(xì)菌或支原體引起的細(xì)胞培養(yǎng)污染風(fēng)險(xiǎn)。但是，病毒(特別是無(wú)包膜細(xì)小病毒)引起的污染風(fēng)險(xiǎn)，即使是在使用化學(xué)限定培養(yǎng)基(1)的情況下，對(duì)生物制藥行業(yè)而言仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
傳統(tǒng)的除菌級(jí)過(guò)濾器,即使是0.1微米的過(guò)濾膜都不能防止無(wú)包膜微小病毒造成的污染。
病毒污染比細(xì)菌污染(3)更難以檢測(cè)。未能檢測(cè)到的病毒可能會(huì)污染整個(gè)下游過(guò)程，甚至是終藥品。許多公司因鼠細(xì)小病毒或皰疹病毒屬(2)污染而遭受了生產(chǎn)損失。針對(duì)所有上述情況，根源分析顯示，可能的源頭是在供應(yīng)鏈(4-6)早期儲(chǔ)存過(guò)程中的培養(yǎng)基組分(如鹽)污染。
圖1：病毒污染事件的逐漸升級(jí)關(guān)聯(lián)效應(yīng)
防止老鼠進(jìn)入這些倉(cāng)庫(kù)的措施不夠充分。
這些污染事件可能對(duì)患者造成致命的后果。
這些無(wú)包膜病毒的穩(wěn)定性高，因此它們可以長(zhǎng)期存活。即使是一個(gè)感染性顆粒也會(huì)污染整個(gè)生物反應(yīng)器。這一個(gè)顆粒會(huì)在生物反應(yīng)器中迅速?gòu)?fù)制。在它進(jìn)入生物反應(yīng)器之前，要在1000 L的培養(yǎng)基中找出這一個(gè)顆粒無(wú)異于大海撈針。
污染影響
這種污染事件可能對(duì)患者造成致命的后果(參見(jiàn)圖1)。如果公司發(fā)現(xiàn)存在污染，不僅需要關(guān)閉工廠，還需要進(jìn)行大量的清潔工作。由此便可能導(dǎo)致藥物短缺，患者不能獲得救生藥物(7)。
上游病毒清除解決方案
上游工藝中需要有新的病毒清除理念。
過(guò)去，研究人員已經(jīng)研究了伽馬輻射、UV-C照射或高溫短時(shí)處理(HTST)等技術(shù)去除細(xì)胞培養(yǎng)基病毒的能力。如牛血清在伽馬照射下能清除大部分的病毒(8)。高溫短時(shí)處理需要大量投資，因此它僅在高流速下處理大量培養(yǎng)基時(shí)才是經(jīng)濟(jì)可行的(9)。然而，并非所有培養(yǎng)基組分都是熱穩(wěn)定的，而高溫短時(shí)處理系統(tǒng)線性放大也并非易事。UV-C受限于可應(yīng)用的流速，因此在制備大體積的培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)用有限。此外，從這些公開(kāi)發(fā)布的方法數(shù)據(jù)來(lái)看，這些技術(shù)在滅活無(wú)包膜細(xì)小病毒方面的效果也良莠不齊。迄今為止，過(guò)濾這項(xiàng)有效的技術(shù)(對(duì)無(wú)包膜病毒特別有效)尚未被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基過(guò)濾(10)。
下游病毒過(guò)濾器的瓶頸
為達(dá)到理想的病毒清除效果，一些公司已經(jīng)采用下游工藝中的除病毒過(guò)濾器來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基的過(guò)濾制備，以此盡量減少病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)樯a(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)，流速低，所以公司可有效地將這些過(guò)濾器用于過(guò)濾灌注生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基中的潛在病毒。采用傳統(tǒng)的下游工藝(DSP)過(guò)濾器過(guò)濾化學(xué)限定培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的過(guò)濾載量相當(dāng)高，能高達(dá)10.000 L/m²(11)。
如果可以在幾天內(nèi)而非數(shù)小時(shí)內(nèi)過(guò)濾這些培養(yǎng)基，傳統(tǒng)的DSP過(guò)濾器則是的解決方案，而且經(jīng)濟(jì)上可行，因?yàn)樾∵^(guò)濾面積已經(jīng)足以滿足需求。然而，在傳統(tǒng)的批量過(guò)濾中，情況并非如此。由于細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，培養(yǎng)基必須在至少24小時(shí)內(nèi)過(guò)濾，且理想情況下是在一個(gè)班次內(nèi)。為了提高過(guò)濾的整體速度，則需要更大的過(guò)濾面積，但這種方法成本昂貴，在經(jīng)濟(jì)上不可行。
經(jīng)濟(jì)上的可行方案
生物制藥行業(yè)需要解決將下游工藝除病毒過(guò)濾器用于上游培養(yǎng)基除病毒過(guò)濾的低流速和高成本問(wèn)題，使其在經(jīng)濟(jì)上可行。這是開(kāi)發(fā)專門用于培養(yǎng)基過(guò)濾(10)的代病毒截留過(guò)濾膜的背景。
方法
截留性能
每個(gè)5.0cm2的實(shí)驗(yàn)室用除病毒濾器都經(jīng)過(guò)了病毒挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)采用了作為“差條件”下的非脂包膜指示病毒-MVM 。它是細(xì)小病毒家族的12-26納米單鏈無(wú)包膜ssDNA病毒。實(shí)驗(yàn)使用5.0cm2的除病毒濾器，在2.0bar的恒定壓力下過(guò)濾3種不同的培養(yǎng)基，并進(jìn)行二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在1%的病毒加入量下，過(guò)濾了400 L/m²。
膜載量測(cè)試
膜過(guò)濾載量采用了三個(gè)不同供應(yīng)商的15種不同培養(yǎng)基來(lái)測(cè)定。所有測(cè)試均在2.0bar的恒壓下進(jìn)行。
表1：新型除病毒培養(yǎng)基濾器的截留能力，實(shí)驗(yàn)室用濾器(5 cm2)。
圖2：在4小時(shí)的過(guò)濾時(shí)間內(nèi)，15種細(xì)胞培養(yǎng)基(CCM)在恒壓2.0bar下的通過(guò)量一覽；培養(yǎng)基除病毒過(guò)濾器，實(shí)驗(yàn)室用。
4小時(shí)過(guò)濾后對(duì)總過(guò)濾量進(jìn)行了測(cè)量。
結(jié)果
截留性能
表1總結(jié)了使用新型膜進(jìn)行測(cè)試的截留數(shù)據(jù)。膜的病毒截留性能同下游工藝應(yīng)用中使用的過(guò)濾器相當(dāng)。無(wú)包膜細(xì)小病毒MVM的截留量超過(guò)4個(gè)對(duì)數(shù)值。分析方法檢測(cè)不到濾液中的MVM?？珊侠眍A(yù)期該膜會(huì)截留比細(xì)小病毒更大的潛在污染因子。
不同化學(xué)限定成分細(xì)胞培養(yǎng)基的膜通過(guò)量
膜的通過(guò)量采用了三個(gè)不同供應(yīng)商的15種培養(yǎng)基來(lái)測(cè)定。圖2表明了在2bar壓力下，4小時(shí)的培養(yǎng)基處理載量因培養(yǎng)基組分不同而差別很大。例如，Lonza Power CHO2相對(duì)較快地造成了膜堵塞，而Lonza ProPER1培養(yǎng)基似乎*不堵膜。
對(duì)于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過(guò)濾器顯著提高了除病毒過(guò)濾膜載量(7)。但僅部分培養(yǎng)基可行，有些則沒(méi)起作用。諸如泊洛沙姆等保護(hù)劑大幅降低了過(guò)濾流速(10)。
對(duì)于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過(guò)濾器顯著提高了膜通過(guò)量。
降低泊洛沙姆濃度或在添加至培養(yǎng)基以前過(guò)濾能大幅提高過(guò)濾器的過(guò)濾量。業(yè)界應(yīng)該展開(kāi)更多研究，從而充分了解不同培養(yǎng)基組分對(duì)培養(yǎng)基過(guò)濾器過(guò)濾性能的影響。根據(jù)本研究，可設(shè)計(jì)出一種既能改善過(guò)濾性能又不影響后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工藝的培養(yǎng)基。不過(guò)，研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)基通常的4小時(shí)過(guò)濾中，開(kāi)發(fā)的新膜通常過(guò)濾載量約1000 L/m2。因此，對(duì)于批量制備培養(yǎng)基，這種新膜是經(jīng)濟(jì)上可行的辦法，同時(shí)也降低了細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。
結(jié)論
在本文中，作者介紹了一種新的病毒截留膜，上游工藝工程師可使用它來(lái)過(guò)濾化學(xué)限定培養(yǎng)基，從而降低風(fēng)險(xiǎn)。此外，作者已經(jīng)證明該方法可截留4個(gè)Log以上的非包膜細(xì)小病毒。當(dāng)過(guò)濾一系列不同型號(hào)的化學(xué)限定培養(yǎng)基時(shí)，該膜的通量較高，生物制藥公司能夠在上游工藝中使用這種膜，而且不會(huì)對(duì)工藝成本造成不利的影響。該膜有可能成為基于風(fēng)險(xiǎn)控制來(lái)zui大程度地降低病毒污染事件的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)提高生物制藥公司的生產(chǎn)能力。
REFERENCES
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